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Site du Collège National de Pharmacologie Médicale

Dosage des médicaments (Suivi Thérapeutique Pharmacologique)

Notions complémentaires

1. Méthodes immunochimiques :

1.1. Principe général

Les méthodes immunochimiques font appel à un anticorps spécifique de la molécule à doser ainsi qu’une forme marquée de ce même composé. La mise en présence d’une quantité connue d’anticorps, de molécule spécifique marquée et d’une quantité inconnue de molécules à doser provenant d’un échantillon, va entraîner la formation de deux types de complexes antigène-anticorps entrant en compétition, l’un avec la molécule marquée, l’autre avec la molécule à doser. Le nombre de molécules marquées se fixant à l’anticorps est inversement proportionnel au nombre de molécules non marquées initialement présentes dans l’échantillon à doser. Il existe ensuite deux méthodes principales de quantification de la réaction : les méthodes en phase homogène et les méthodes en phase hétérogène. Ces dernières nécessitent la séparation des formes liées et des formes libres car il n’existe pas de différence entre les signaux produits par chacune des formes. C’est le cas notamment de la radio-immunologie, mais ces techniques, nécessitant une étape supplémentaire, ne sont plus utilisées dans le dosage du médicament. À l’inverse, lorsque le marquage est réalisé par une enzyme ou un fluorophore, la mesure est réalisée par un changement optique généré par une différence de comportement entre la forme libre et la forme liée. Ce sont les méthodes en phase homogène, plus rapides et entièrement automatisables.

1.2. Méthodes en phase homogène

Deux méthodes de quantification du complexe antigène-anticorps sont utilisées : la technique Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) et l’immunopolarisation de fluorescence (FPIA).

Dans la méthode EMIT (figure 1), le marquage est réalisé par une enzyme. La fixation de l’anticorps à cette molécule marquée masque l’enzyme. L’introduction d’une molécule non marquée (molécule à doser) libère une partie des molécules marquées, pouvant réagir alors avec un substrat. L'intensité de la réaction sera donc proportionnelle à la quantité de molécules à doser. La quantification de la réaction enzymatique est le plus souvent réalisée par lecture optique dans l’ultraviolet (340 nm) en mesurant la consommation de nicotinamide dinucléotide oxydé (NAD+), cofacteur de la réaction.

M + M-E + Ac + Substrat + NAD+ à M-Ac + M-E-Ac + M-E + NADH,H+

(inactif)
où M est la molécule à doser, M-E est la molécule marquée, Ac est l'anticorps spécifique de la molécule à doser et NADH est le NAD réduit.

Figure 1. Principe de la méthode EMIT

4.1.2.figure1

On utilise un antigène marqué par une enzyme. Exemple d'enzyme : glucose 6-phosphate deshydrogénase. Cette technique est fondée sur la compétition entre la molécule à doser (Ag) et l'antigène marqué par une enzyme (G6PDH) pour occuper les sites de liaison des anticorps. La fixation de l'Ag (médicament) à l'Ac libère l'Ag marqué par l'enzyme qui va pouvoir réagir avec un subtrat : l'enzyme passe alors de la forme inactive à la forme active et devient donc capable d'hydrolyser le substrat (exemple de substrat : glucose 6-phosphate). La lecture est obtenue dans l'UV par la réduction de nicotinamide dinucléotide (NAD), cofacteur de la réaction, qui se transforme en NADH absorbant à 340 nm. L'absorbance ou la variation d'absorbance engendrée par la réaction permet la quantification de la molécule à doser par comparaison à une courbe de référence.

Dans la méthode par polarisation de fluorescence (FPIA, figure 2), le marquage de la molécule est réalisé par un composé fluorescent. La révélation du complexe antigène-anticorps est basée sur la différence de rotation de la lumière induite par la forme libre ou liée de la molécule marquée. À l’état libre, la molécule marquée tourne librement et rapidement induisant une polarisation faible. Lorsqu’il n’y a pas de molécule à doser, la molécule marquée se fixe sur l’anticoprs, formant une grosse molécule à rotation faible, induisant une polarisation élevée de la lumière incidente.

Figure 2a. Méthode FPIA : mécanisme - peu de substance à doser

4.1.3.figure2a

Figure 2b. Méthode FPIA : mécanisme - beaucoup de substance à doser

4.1.3.figure2b

Il s'agit d'une réaction Ag-Ac où l'on met en présence un antigène (la substance à doser), une quantité connue du même antigène marqué à la fluorescéine (traceur), une quantité connue d'anticorps (Ac) spécifique de l'Ag. Lors de la réaction, il y a compétition entre l'antigène marqué et la substance à doser pour se fixer sur l'Ac, du fait du nombre limité de sites à occuper. Si la substance à doser est en faible quantité dans l'échantillon (figure 2a), beaucoup de traceur sera fixé sur l'Ac. Au contraire, si la quantité de substance à doser est importante, le traceur sera peu fixé à l'Ac et restera libre dans le milieu réactionnel (figure 2b).

Figure 3a. Mesure de la polarisation de fluorescence - peu de substance

4.1.3.figure3a

Figure 3b. Mesure de la polarisation de fluorescence - beaucoup de substance

4.1.3.figure3b

La lumière polarisée est émise vers le milieu réactionnel et la polarisation de la lumière réémise est mesurée. Si peu de médicament dans l'échantillon : les molécules de traceur se fixent sur les Ac. Il y a donc une majorité de grosses molécules fluorescentes, qui tournent lentement : la polarisation mesurée est élevée (peu de dépolarisation de la lumière initiale) (figure 3a). Si beaucoup de médicament dans l'échantillon : les molécules à doser occupent la majorité des sites Ac. Le traceur se trouve à l'état libre, sous forme de petites molécules qui tournent rapidement : la polarisation mesurée est faible (forte dépolarisation de la lumière initiale) (figure 3b).

1.3. Dosages possibles en immunochimie

Acide salicylique
Acide valproïque
Amikacine
Carbamazépine
Ciclosporine
Diazépam
Digitoxine
Digoxine
Disopyramide
Ethosuximide
Gentamicine
Imipramine
Lidocaïne
Méthotrexate
Mycophénolate
Nétilmycine
Paracétamol
Phénobarbital
Phénytoïne
Primidone
Procaïnamide
Quinidine
Tacrolimus
Théophylline
Tobramycine
Vancomycine

2 . Méthodes chromatographiques :

Deux types de méthodes chromatographiques existent pour le dosage du médicament : les méthodes par chromatographie gazeuse et celles par chromatographie liquide.

2.1. Méthodes en chromatographie gazeuse

Figure 4 : Méthodes en chromatographie gazeuse

6.4.3.figure4.jpg4.1.3.figure4L’étape séparative est réalisée sur une colonne contenant une phase stationnaire liquide ou solide tandis qu’un flux de gaz vecteur réalise l’élution des composés et les entraîne vers un détecteur. Après introduction des molécules à séparer dans la colonne, les molécules vont se répartir entre la phase stationnaire et la phase gazeuse. La séparation des molécules va reposer sur un gradient de température appliquée à la colonne. Les molécules ayant le plus d’affinité pour la phase stationnaire y séjournent plus longtemps, atteignant le détecteur plus tardivement. Celui-ci produira alors un signal proportionnel à la quantité de molécule à doser. Dans des conditions prédéfinies de chromatographie, chaque produit sera caractérisé par un temps de rétention caractéristique de ce composé. 

Les détecteurs sont multiples, les plus répandus étant les détecteurs à ionisation de flamme, les détecteurs thermoioniques, les détecteurs à capture d’électrons et les détecteurs de type spectromètre de masse, présentant une sensibilité et une spécificité accrue. La chromatographie en phase gazeuse est utilisée pour les molécules volatiles et thermostables compte tenu des températures élevées utilisées dans cette méthode.

2.2. Méthodes en chromatographie liquide

Figure 5 : Méthodes en chromatographie liquide

4.1.3.figure5

En chromatographie liquide, appelée chromatographie liquide haute performance ou CLHP, une phase mobile constituée par un mélange de solvants traverse une colonne contenant la phase stationnaire constituée de billes de faible diamètre (le plus souvent inférieur à 5 µM). La séparation des composés de l’échantillon peut être améliorée en appliquant un gradient de solvants au sein de la phase mobile au cours de la chromatographie.

Les détecteurs les plus utilisées sont le détecteur UV-visible, à fluorescence, électrochimique, à barrette de photodiodes permettant l’acquisition du spectre UV complet de la molécule détectée et donc une meilleure spécificité et la spectrométrie de masse alliant là encore spécificité et sensibilité. 

La chromatographie liquide permet l’accès au dosage de molécules instables thermiquement ou non volatiles.

3 . Validation d'une méthode de dosage :

Toute méthode de dosage de médicament utilisée par un laboratoire doit avoir été validée préalablement à son utilisation en routine. Concernant les méthodes immunologiques, cette validation a lieu nécessairement avant la mise sur le marché du réactif de dosage, condition exigée auprès de la société qui commercialise le kit pour obtenir l’autorisation de mise sur le marché (AMM). Concernant les méthodes chromatographiques, chaque laboratoire doit valider ses techniques.

La validation d’une méthode permet d’en déterminer ses performances ainsi que ses limites. Une validation de méthode va permettre de définir :

- la spécificité : garantit que le signal mesuré est uniquement dû au médicament à doser.
- la sélectivité : capacité d’une méthode à différencier le médicament d’autres substances (notion d’interférences analytiques).
- la linéarité : fourchette pour laquelle le signal obtenu est directement proportionnel à la concentration du médicament.
l’exactitude ou justesse ou biais : écart entre la valeur théorique d’un standard et les valeurs expérimentales mesurées de ce standard.
- la précision ou fidélité : écart entre les différentes valeurs mesurées d’un standard au cours du temps. Elle est exprimée par un coefficient de variation de ces valeurs mesurées dans une même série (variation intra-jour) et dans plusieurs séries (variation inter-jour).
- la limite de détection : plus faible concentration du médicament qui peut être différenciée du bruit de fond mais pas nécessairement quantifiée.
- la limite de quantification : plus faible concentration du médicament à doser qui peut être quantifiée avec exactitude et précision.

Après la validation initiale, la qualité des analyses est vérifiée par :

des contrôles de qualité internes. Ce sont des échantillons avec une concentration connue de médicament, qui sont analysés dans les mêmes séries que les échantillons de patients. Si le résultat obtenu est trop éloigné de la valeur attendue, les conditions techniques doivent être vérifiées.
des contrôles de qualité externes. Ce sont des échantillons préparés par un laboratoire extérieur (national ou international), reçu 3 ou 4 fois par an, dont on ne connaît pas la concentration, et qui permettent une validation externe des résultats rendus par le laboratoire. Ils permettent également de vérifier l’homogénéité des résultats des différents laboratoires participants.

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